ACTO schafft Alternativen zum Tierversuch

1. Das Testprinzip
2. Förderung BMBF (REACT)
3. Die Heilung am Auge ohne Tierversuche (Pharma)
4. Die Entwicklung einer Verätzung am Auge
5. Optimale Therapie einer Augenverätzung ohne Tierversuch
6. Hornhautentzündung
7. Simulation des Trockenen Auges
8. Untersuchung kosmetischer Produkte (Colipa)

Ersatz für Tierversuche: Wisenschaftspreis geht nach Aachen (Pressemitteilung lesen)

1. Das Testprinzip
Ex Vivo Eye Irritation Test (EVEIT) ersetzt Tierversuche im Bereich der Augen.

Der Ex Vivo Eye Irritation Test ersetzt den DRAIZE Test und kann Tierversuche in der Pharmaforschung am Auge ersetzen. Augen von Schlachtkaninchen werden so behandelt, daß sie für einige Wochen kultuviert werden. Damit ist eine Methoden verfügbar die  Versuche am lebenden Tier (also Tierversuche) entbehrlich macht und das bei gleichwertiger bzw. sogar deutlich besserer Aussagekraft. Wesentliches Kriterium dieser Methode ist die Heilung von Wunden, chemischen Verletzungen in vitro.
Die so an der Hornhaut durchgeführten Versuche dienen dem Ziel, Wirkung, Verträglichkeit und Nebenwirkungen wie z.B. Verkalkungen durch phosphathaltige Augentropfen vor der Anwendung am Menschen zu erkennen.

Wirkungen am Auge lassen sich unterteilen 

• Pharmazeutische Wirkungen auf das Auge
• in akute Veränderungen durch Gifte, ätzende Substanzen, mechanische und physikalische Einwirkung
• in längerfristige Veränderungen nach einmaligem und mehrmaligem Kontakt
• Mikrobiologische Einwirkungen.

Die Akutprüfung wird im Test „EVEIT–acute“ untersucht. In diesem Test sind Trübungen der Hornhaut, Veränderungen der Oberfläche und der tiefen Hornhaut durch spezielle Untersuchungsmethoden (Mikroskop, optische Kohärenztomographie, Biochemie und Histologie) zu sehen. Längerfristige Veränderungen nach einem solchen einmaligen Kontakt und insbesondere die Frage, ob sich das Gewebe noch einmal regenerieren kann, lassen sich nur dann beurteilen, wenn eine solche Hornhaut weiter am Leben erhalten wird.
Dies gelingt im „EVEIT–longterm“-Test bis zu 20 Tage. Die Hornhaut wird in einer speziellen, dem Auge nachempfundenen Kammer mit Nährmedium versorgt und feucht gehalten. Unter diesen Bedingungen zeigt sich bei einmaligen Kontakten mit Substanzen, ob die Hornhaut komplett oder nur der Defekt heilt oder ob keine Heilen der Hornhaut erfolgt.

Eine zweite, weitaus schwieriger zu beantwortende Frage stellt sich bei mehrfachem Kontakt der Hornhaut mit einer Substanz, wie dies z. B. typischerweise bei Augentropfen, aber auch bei Kosmetika der Fall ist. Hier sagt ein einmaliger Kontakt nicht all das aus, was für den nachher betroffenen Patienten oder Menschen von Wichtigkeit ist.
Im Ex Vivo Eye Irritation Test können über Tage bis zu 100 Applikationen pro Tag auf eine Hornhaut aufgetragen werden. Das wäre im Tierversuch oder auch gar im Versuch am Probanden niemals möglich ist. Somit lässt sich eine zeitraffer-artige Reaktion auf chronische Reize darstellen.

All diese Untersuchungen zu chronischer und akuter Gefährlichkeit von chemischen Stoffen lassen sich auf einer Hornhaut miniaturisiert an verschiedenen Stellen der Augenoberfläche im „EVEIT –multilocal“ testen. So können mehrere Tests auf einem Auge zusammengefasst werden. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, eine Referenzsubstanz sowie verschiedenartige Substanzen oder verschiedene Konzentrationen einer einzigen Substanz in einem Ansatz auf dem Auge zu testen. Mit diesem Ansatz lassen sich große Versuchsserien zusammen kondensieren und intern referenzieren. Die vorhandene Individualität eines jeden Hornhautexplantates wird damit gleichzeitig zur Referenz, und Vergleiche der Schwere einer Schädigung innerhalb eines einzigen Hornhautstückchens sind systematisch anstellbar.

Dies führt zu einer Vereinfachung und Beschleunigung der Testergebnisse.

Verwendete Methoden

Für den „EVEIT–acute“ – Versuch werden frisch entnommene Augen von toten Kaninchen aus einer Kaninchenschlachterei benutzt. Diese werden in einem Halter eingespannt und mit den entsprechenden chemischen Substanzen in Kontakt gebracht. Danach wird mittels Mikroskopie und optischer Kohärenztomographie das Auge und seine Reaktion auf die chemische Substanz genau beobachtet.
Im Langzeit-Ex-Vivo-Eye-Irritation-Test (EVEIT – longterm) werden Hornhäute von toten Kaninchen, die aus der Lebensmittelherstellung stammen, heraus präpariert und in eine künstliche Augenkammer übernommen. In dieser Kammer werden sie ernährt und mikroskopisch überwacht, sodass eine gesunde Hornhaut nach 24 Stunden in der Kultur lebt. Der Zustand der Hornhaut wird anhand von biochemischen Messwerten, der Prüfung auf Klarheit, Stabilität des Epithels (äußere Deckschicht) und Funktionieren des Endothels (innere Deckschicht) überprüft. Erst wenn diese Kriterien erfüllt sind, können die Hornhäute für 3 bis 20 Tage in einem Brutschrank speziellen Tests unterzogen werden.

Mögliche Tests sind eine multilokale Exposition, eine Augentropfapplikation, eine Applikation von niedrig- oder hochdosierten wiederkehrenden chemischen Substanzen, Flüssigkeiten, Gasen, aber auch Partikeln.

Während dieser Untersuchung kann die Hornhaut immer wieder beobachtet und Längsschnittbetrachtungen über diese Zeit vorgenommen werden. Mit diesem System lassen sich kleinste Veränderungen aufspüren, die beim Menschen erst nach Jahren zu Veränderungen des Auges führen. Die Möglichkeit, innerhalb kurzer Zeit extrem viele Applikationen durchzuführen, führt zu einer zeitraffer-artigen Herstellung von Effekten an der Hornhaut.

In vielen Experimenten und Publikationen können wir diese Effekte belegen. Das Projekt wird derzeit für die Validierung zum Ersatz von Tierversuchen bei der Europäischen Kommission zur Validierung von alternativen Methoden (European Centre for the Validation of Alternative Methods = ECVAM) vorbereitet.

2. BMBF-Förderung

Das Bundesministerium für Bildung und Forschung förderte das Projekt REACT – Rating Eye exposure by an Advanced self-healing Culture Test von 2010 bis 2011. Die tierversuchsfreie Testung von Chemikalien am Auge wurde weiterentwickelt. Die Fördergelder in Höhe von etwa 500.000 Euro haben in einer Serie von wiederholten Experimenten an 32 Referenzsubstanzen, welche von einem Beirat aus Industrie, ECVAM, BFR und Forschungseinrichtungen bestimmt wurden, neue Ergebnisse zur Reaktion des Testsystems erbracht. Insgesamt hat das Testsytem eine hohe Voraussagesicherheit in der Beurteilung von Chemikalien in ihrer Wirkung auf das Auge. Die Kategorisierung von Kategorie I, II und NI  nach der GHS Klassifikation wurde in 27 von 32 Substanzen richtig vorhergesagt, In 5 Fällen war der Test noch unterprädiktiv. Dieses Ergebnis wird derzeit sorgfältig überprüft. Im Projekt konnten die Entwicklung vereinfachter Präparations- und Analyseverfahren im EVEIT vorangetrieben werden. 

Weiterentwicklung des Ex Vivo Eye Irritation-Tests mit kompetenten Partnern

In den letzten 10 Jahren hat ACTO einen Laborprototypen dieses so genannten Ex Vivo Eye Irritation Tests (EVEIT) gemeinsam mit der Universitätsaugenklinik in Aachen entwickelt und publiziert. Dieser soll innerhalb des Projektes zu einem industriell anwendbaren und behördlich anerkannten Verfahren weiterentwickelt werden.

Das Institut für Halbleitertechnik steuert diesem Projekt ein spezielles optisches Verfahren bei, die Optische Kohärenztomographie. Mit diesem Messverfahren ist eine objektive Dokumentation und Quantifizierung der Auswirkung von Chemikalien auf die Hornhaut erstmals möglich. Damit wird die subjektive Bewertung von Tieraugen durch objektive Laborparameter ersetzt.

Mit der Innolabtec GmbH ist ein Partner im Projekt, der sich exzellent mit Steuerung, Automatisierung und Roboterentwicklung für labortechnische Prozesse auskennt. Damit können die bisher im Labor konzipierten Einzelkomponenten des EVEIT in einen technisch ausgewogenen und ablaufsicheren Prozess überführt werden. Mit diesem Schritt rückt die großtechnische Anwendung des Tierversuchersatzes in greifbare Nähe.

Der EVEIT beruht auf der Langzeitkultur von Kaninchenhornhäuten, welche von Tieren stammen, die für den Verzehr ohnehin geschlachtet wurden. Als wesentliches Alleinstellungsmerkmal gegenüber anderen tierversuchsfreien Tests, die derzeit entwickelt und genutzt werden ermöglicht der EVEIT eine langfristige Beobachtung der Schädigung über einen Zeitraum von bis zu 21 Tagen. Damit sind typische Heilungsvorgänge an der Hornhaut erstmals tierversuchsfrei im Labor darstellbar. Dadurch kann die Rückbildung und Heilung oder auch das Ausbleiben einer Heilung für chemische Schädigungen des Auges mit hoher Sensitivität vorhergesagt werden. 

Alternativen zum Tierversuch: Das 3R-Prinzip Replace, Reduce, Refine

Dadurch wird insbesondere der allgemein anerkannten ethischen Notwendigkeit für Alternativen zum Tierversuch Rechnung getragen. Dieses Ziel einer „humanen Wissenschaft“ (Rex Burch) wurde vom Zoologen William Russel und dem Mikrobiologen Rex Burch erstmals 1959 in ihrem Buch „The Principles of Humane Experimental Technique“ formuliert und ist heute als 3R-Prinzip bekannt (= Replace: Ersatz  von Tierversuchen durch Alternativen, Reduce: Reduktion der Zahl von Versuchstieren, Refine: Verringern des Leidens von Versuchstieren durch schonendere, weniger belastende und aussagekräftigere Versuche).

Mit der Vereinfachung der Inkulturnahme der Hornhäute bis hin zur Standardisierung von Prozessschritten, deren Eignung in einem Interlaborvergleich (ein parallel in verschiedenen Laboren durchgeführter Versuch) nachgewiesen wird, soll auf Basis der Kombination aus Hornhautkultur und bildgebender Analytik ein Verfahren etabliert werden, das eine innovative und universelle Plattform für alternative tierversuchsfreie Forschung bildet und vorgeschriebene Untersuchungen im Rahmen der neuen EU-Chemikalienverordnung (REACH) und der EU-Direktive zur Bewertung von Kosmetika und Pharmaka erlaubt.

Ex Vivo Eye Irritation Test (EVEIT) bedeutet

• Nahe an der Realität des Draize Tests 
• Standardisierte Expositionen
• Reproduzierbare Ergebnisse
• Höchste Präzision der Analytik
• Prädiktive Ergebnisse
• Heilung und Freisetzung von Entzündungsbotenstoffen

ACTO hat mit EVEIT ein System entwickelt, das Tierversuche ersetzt, verbesserte Ergebnisse liefert und die Anzahl von Tierversuchen insgesamt reduzieren kann.

Beispiele der hier genannten Effekte: EVEIT-Grundlagen Publikation ISOT 2006 

Verkalkung der Hornhaut nach Verletzung und Applikation von phosphathaltigen Augen-tropfen.

Epithel und Endothelnekrosen als verspätete Folge von Wasserstoffperoxid-vergiftung der Hornhaut.

Freisetzung von Entzündungsstoffen (Mediatoren) durch verschiedenste Reize.  VEGF-165 ist in der Peroxidgruppe stark messbar. Da das Detektionslimit bei 0.81 liegt, befinden sich die erzielten Werte sicher im Messbereich. Die VEGF-Werte wurden aus gepoolten Proben acht unterschiedlicher Hornhäute der jeweiligen Verätzungsversuche (ohne Trauma, 3% H2O2, 2n NaOH und Tomadol 14-5) bestimmt.

Dosis-Wirkung Beziehung von steigenden Konzentrationen von Benzalkoniumchlorid.

 REACT in der Presse:

• RWTH inside (Dezember 2009)
• Super Sonntag (3.1.2010)

Heilung am Auge über mehrere Tage ist auch ohne ein lebendes Tier nachweisbar.